在中关村科技园区昌平园的北京希诺谷生物科技有限公司的繁育实验室，一只黑白黄相间的小狗正吮吸着“母亲”的乳汁。不过，生下它的是代孕妈妈——一只普通的比格犬；它的供体细胞则来自世界首例人类基因编辑疾病模型犬“苹果”。
世界首例基因编辑克隆犬“龙龙”出生第28天，它是世界首例基因编辑疾病模型犬“苹果”的克隆犬。
这条名叫“龙龙”的小狗是我国首例完全自主培育的体细胞克隆犬，更是世界首例基因编辑克隆犬。
听了是不是很晕？通俗地说，就是人们对狗敲入或敲除某个基因，对它“功能定制”；然后以其为模本进行复制或“批量”生产，即克隆。这在我国甚至世界还是头一次。最近，第二只代孕犬又生了两只“苹果”的克隆犬，并经过DNA同一性鉴定。
世界首例基因编辑动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”。
“这标志着我国成为继韩国之后，第二个独立掌握犬体细胞克隆技术的国家。” 中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员告诉科技日报记者，基因编辑技术对动物性状干预，克服了克隆动物本身带来的生理缺陷，并按照人类意愿向更好更健康的方向发展。
通过“基因编辑+克隆”技术，狗可以根据需要变得嗅觉更灵敏、肌肉更发达或者罹患某种疾病。按照理论，“定制”动物就可以实现“批量”复制。
科研人员在实验室进行犬体细胞核移植实验。本报记者 洪星摄
基因编辑，神奇的剪刀
这是一个奇妙的故事。先从“龙龙”的供体“苹果”说起。“苹果”是一只比格公犬，出生于2016年12月29日，20天后，另外一只比格犬“葫芦”也顺利出生了。经过近半年的观察与检测，这两只幼犬都表现出一些动脉粥样硬化的典型症状，如脂类代谢发生紊乱、高血脂等，这正是研究人员希望看到的。“苹果”就此成为世界首例动脉粥样硬化疾病模型犬。
动脉粥样硬化是一种老年多发性疾病。在众多的发病因素中，有个叫做APOE的关键基因，对脂质的运输和代谢发挥主要作用。如果敲除犬的APOE基因，可使其血浆胆固醇升高，诱发粥样硬化病变。“苹果”得名也是缘于这个基因的读音。“苹果”和“葫芦”就是被敲除了这个基因。作为一种疾病模型动物，它俩可以被人类用来研究动脉粥样硬化疾病发生机理以及验证新药疗效。
“龙龙”正在吮吸“代孕狗妈妈”的乳汁。本报记者 洪星摄
那么，如何让功能基因想要就要、想没就没呢？研究人员利用的是最近生物学上“红得发紫”的第三代最新基因编辑技术CRISPR/Cas9，它具有构建简单方便、基因打靶效率更高等特点。目前世界各国科学家已利用该技术成功培育出基因编辑牛、羊、猪、兔、小鼠、大鼠等动物以及人类胚胎。
在狗狗身上打主意，实现基因敲除，并非首次。2015年，赖良学取得世界首例基因打靶犬，通过敲除犬肌肉生长抑制素基因，让其比普通犬更加肌肉发达。其中一条狗也因此得名“大力神”。
该项科研成果为基因编辑犬的制备开辟了新方法。随后，希诺谷公司科研团队在赖良学带领下利用该技术，敲除犬APOE基因，首次将其应用于人类遗传疾病犬模型的培育，并取得成功。
刚刚出生的“龙龙”。
好多动物被克隆，为什么狗剩下了
有了“苹果”后，研究人员就开始对它进行体细胞克隆。因为体细胞克隆技术能一次性培育出一批遗传背景一致、年龄相近的实验犬，便于更有效地筛选出疗效显著的新药，于是就有了“龙龙”。
其实，克隆并不是新鲜事。1996年第一只体细胞克隆绵羊“多莉”诞生后，小鼠、牛、山羊、猪、猫、兔、骡、马、大鼠等多种哺乳动物的体细胞克隆相继获得成功。但克隆犬却迟迟没做出来，因为犬被科学界普遍认为是最难克隆的动物之一。
“在模式动物中，犬比猪的应用历史更长，但由于犬克隆技术不成熟，犬的疾病模型工作也一直推展不开。”赖良学介绍，犬克隆难是因为犬卵母细胞质量较差，犬克隆胚制备技术难度大；犬发情持续时间长，因而克隆胚与代孕母的生殖周期难以同步化等。这都成为犬体细胞克隆的瓶颈，制约了该技术的应用。
“苹果”因敲除了APOE基因，产生动脉粥样硬化的疾病表型。本报记者 洪星摄
体细胞克隆犬直到2005年才由韩国科学家黄禹锡成功制备。黄禹锡？对，没错，就是那个因干细胞造假跌下神坛的学术大牛，但他在克隆犬方面的贡献还是有目共睹的。他开发的克隆犬“独门绝技”让韩国足足“笑傲世界江湖”十几年。
但这个垄断终于被中国人打破了！希诺谷公司相继攻克了犬体细胞系建立、卵母细胞供体犬的发情鉴定、成熟卵母细胞的获取、体细胞核移植、胚胎融合激活及胚胎移植等技术难题，建立了具有自主知识产权的犬体细胞克隆技术平台。“我们通过优化体细胞克隆技术平台，提高了犬克隆胚胎的着床效率。着床效率最高的一次是移植了7枚胚胎，有5枚胚胎成功着床，最终生了2只健康的克隆犬；而据韩国报道，出生一只克隆犬，最少要移植12枚胚胎。此外，我国克隆犬目前的怀孕率在50%左右，高于韩国。” 从事此工作的冯冲博士介绍。
对生命科学的理解更深刻
开发基因编辑克隆犬技术有什么用？在中国农业大学动物医学院施振声教授看来，最重要的还是生物学的意义。“它使我们对生命科学特别是克隆技术的理解更加深刻。狗的生殖生理系统与其它哺乳动物有巨大差异，克隆非常难，这次成功说明中国生物技术的飞跃。”
“基因编辑疾病模型犬具有很大优势，将有助于人类医药和遗传疾病的研究，同时也会促进兽医学发展。”施振声说，犬是非常理想和成熟的实验动物，犬与人类在营养代谢、生理解剖等方面有很多相似点，犬有900种遗传疾病，其中有400多种与人类遗传相似。而且狗温顺，易控制、易配合，是药筛的主要动物之一。
冯冲介绍，传统的制备犬疾病模型的主要方法是饲喂法、机械损伤法及免疫学方法等，就是在健康动物的基础上，采用特殊的方法诱导使其出现疾病表型；而对犬基因组进行基因编辑，其疾病症状为原发症状，表型持续时间长，且具有可遗传性，通过自然繁殖即可获得子代疾病模型犬。
“目前，已有一些药企与我们联系，公司预计2017年将获得自闭症等5至6种疾病模型犬。”希诺谷公司联合创始人米继东透露。
公安部南昌警犬基地党委书记叶俊华认为，基因编辑克隆犬另一个应用领域，就是缉毒犬、搜救犬、军犬及导盲犬等均有特殊用途的工作犬市场。工作犬以前通过自然繁育，好的品种选育困难，需求大成本高。
而通过基因改造，可以使狗肌肉棒棒哒，嗅觉灵灵的，更聪明抗疲劳，扑咬能力较普通狗更胜一筹等。目前，韩国已经开辟了这一市场。
“犬是人类最主要的伴侣动物，犬的寿命一般只有十几年，克隆犬可以从某种程度上延续主人对过世宠物犬的感情。”施振声介绍，在宠物犬克隆方面，韩国和美国已有先例。
在韩国，黄禹锡以各种方式赠送给个人或机构数百只克隆犬。米继东对中国克隆宠物犬市场也充满信心：“韩国克隆犬的价格是10万美金一只，我们凭借稳定的技术体系，再加上商业推广，达到一定规模后，有望将成本降到一半。”
不过，近几年，韩国也有企业开始进入中国克隆动物商业市场，中国本土企业能否分庭抗礼，让人拭目以待。（本报记者 陈 磊）
